1. 引言

季节性流行性感冒是由流感病毒所引起的急性上呼吸道感染症，病原为一种正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)的滤过性病毒，主要感染途径经由飞沫或直接接触病人的分泌物而感染，病毒会在人类上呼吸道黏膜上皮细胞进行复制后，破坏上皮细胞并且大量扩散与破坏，进而造成肺炎，引起的症状包括发烧、全身肌肉酸痛、头痛、咽喉发炎，鼻炎，偶尔会出现咳嗽及虚弱等症状 [1]。此疾病可发生在所有的年龄层，且幼童、老人(大于65岁)或慢性病患者由于免疫功能降低，常引起严重的合并症如继发性细菌性肺炎(secondary bacterial pneumonia)、原发性病毒性肺炎(primary viral pneumonia)、脑炎(encephalitis)或脑病变(encephalopathy)、心肌炎(myocarditis)或心包膜炎(pericarditis)及雷氏症候群(Reye syndrome)等进而造成死亡，且由于流感病毒传染速率极快，往往在短时间内导致大量人口感染 [2]。病毒学分类中，流感病毒属于一种负向单股RNA病毒，依其所拥有之醣蛋白产生的抗原性蛋白，可分作A、B、C及D型四种，其中，尤以A及B型为目前被解析最具传染人类能力的类型。目前临床上已有针对流感所开发出的药物，例如克流感(Tamiflu®)，为一种神经氨酸酶的特异性抑制剂，其抑制神经氨酸酶的作用，可以抑制成熟的流感病毒脱离宿主细胞，从而抑制流感病毒在人体内的传播，以起到治疗流行性感冒的作用。但因流感病毒属于RNA病毒，于分类学上属于具有及高变异性的病毒，若长时间使用药物治疗即可能产生病毒抗药性，而使治疗失效，且其用量亦受限于其药物毒性，用途上限制相当多，因此找出具有抗病毒效用的天然物质为非常需要的课题。

桑黄(Sanghuangporus sanghuang)为一种于中国被人类食用逾千年之久的药用真菌，其被认为具有良好的药用效果 [3]。由于过去因形态学及分子鉴定技术不成熟，一度被误认其学名为Inonotus sanghuang，直到Wu等人于2012年重新鉴定并确认为新属Sanghuangporus，才正式改命名为Sanghuangporus sanghuang [4]。菌种鉴定结果确认后，本报告所用之桑黄(Sanghuangporus sanghuang)菌丝体亦经菌种鉴定且已经过动物实验证实其安全性 [5]。近来许多研究报告皆证实桑黄具有抗发炎、抗肿瘤、抗过敏、抗血管新生、抗氧化、调节血糖、调节血脂以及免疫调节之作用 [6] [7]。上述各药理效用被认为是源自于桑黄子实体内所含之小分子化合物(Low-molecular-weight compounds)，例如，Hispidin是一种被认为存于桑黄之中的独特多酚类化合物，此物质已被多数研究证实具有抗氧化 [8]、抗肥胖 [9]、抗癌 [10]、抗病毒 [11]、抗过敏 [12]、抗菌以及抗过敏 [13] 等功效。而另一种被认为是桑黄活性成分的Hypholomine B (HB)亦被确认为具有抗氧化、抗菌及抗病毒等功效 [14]，但Hwang等人所使用之样品为Phellinus baumii子实体，不仅分类与本实验室所用桑黄不同，本报告亦使用不同的培养方式及部位，桑黄(Sanghuangporus sanghuang)液态发酵菌丝体至今为止鲜少被探讨其抗病毒功效。

综合上述，本研究旨在探讨液态发酵培养之桑黄菌丝体是否可产生有效抑制H1N1流感病毒之感染功效成分，并探索最佳处理病毒模式，以期后续可以大量生产低廉辅助抗流感病毒之产品。

2. 材料与方法

2.1. 菌种

2.1.1. 来源

本篇报告所用桑黄菌丝体与Li等人于2020年所发表报告的样品相同，系由关西镇(台湾，新竹县)山区间采集之野生子实体中所分离而得。将菌丝体纯化培养后使用Internal transcribed spacer (ITS)序列鉴定法鉴定真菌种类，在完成菌种鉴定后寄存于食品工业发展研究所 [5]，生物资源中心菌种编号为BCRC930210。

2.1.2. 液态发酵菌丝体发酵条件

由桑黄菌丝体琼脂平板上取约1 cm³之小方块投入装有1.0 L之配方培养基(内含1%葡萄糖、0.3%酵母抽出物、0.05% MgSO₄，并将溶液调整至pH 5)的2升大摇瓶内，使菌丝体于25℃环境下以转速120 rpm之条件震荡培养7天，而后逐步由摇瓶接种至500 L以及20 ton发酵槽进行大量培养。经10天的培养后，所得之菌丝体发酵液则进行收槽加热、冻干以及磨粉程序，将桑黄菌丝体冻干粉存放于室温处，待进一步分析或萃取流程。

2.2. 样品制备与分析方法

2.2.1. 桑黄萃取物制备方法

菌丝体冻干粉末秤重后，将粉末与纯水以重量比1:20之比例混合加热121℃，30分钟，而后将萃出液体离心去除沉淀物，将上清液进行冷冻干燥即得水萃取物。酒萃取物则是将菌丝体冻干粉末用乙醇以重量比1:20之比例混浸泡震荡萃取1小时，连续萃取三次，合并萃取液经减压浓缩后，即获得酒萃取物。将得到的酒萃取物与依序与正己烷、二氯甲烷及正丁醇溶剂进行分配分离萃取(partition)，则获得正己烷层(PlHex)、二氯甲烷层(PlDCM)、正丁醇层(PlBtOH)及水层(PlH2O)共四个分层，并分别进行UPLC分析及活性测试。

2.2.2. 萃取物分析法

以上四个分层利用逆相UPLC (Agilent 1290 infinity II)进行分析，使用分析级管柱(kinetex 1.7 µm C18 100 × 3 mm)，DAD检测波长设在380 nm，流动相为0.1%甲酸:乙腈 = 85:15~60:40 (0~10 min)、60:40~0:100 (10~10.1 min)、0:100 (10.1~12 min)、0:100~85:15 (12~12.5 min)及85:15 (12.5~15 min)，流速1 ml/min之条件下进行分析。Hispidin标准品购自于Sigma，HB标准品则由本实验室自行纯化而得。

2.3. 病毒株

2.3.1. 来源

流感病毒株为A型流感病毒A/WSN/33 (H1N1)，由中央研究院基因体研究中心詹家琮博士所提供，为1993年分离之病毒株。

2.3.2. 培养及增幅(Virus Amplify)

将A型流感病毒(H1N1)液注射100 μL (约100 TCID50)入SPF (Specific pathogen free)鸡胚蛋的尿囊膜后以蜡封住洞口进行繁殖，放在培养箱中培养1至2天，再放入4℃等待凝结，最后再将尿囊膜中液体抽出，置入−80℃保存。

2.4. 细胞株

2.4.1. 来源

MDCK (Madin-Darby Canine Kidney cells)：犬肾上皮细胞，购自食品工业研究所之生物资源中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)，细胞株编号为BCRC 60004。

2.4.2. 细胞保存

细胞经计数后，将其浓度调整为1 × 10⁶细胞/mL，添加培养液与最适培养浓度之FBS，并加入10% DMSO作为抗冻剂，再注入冻管中。将冻管放入注满异丙醇(isopropanol)之渐冻盒，再置于−80℃隔夜后转存放于液态氮中保存。

2.4.3. 细胞活化

首先于细胞培养皿中加入9 mL DMEM及1 mL FBS备用，再将保存于−80℃冻藏柜或是液态氮中的细胞株在37℃水浴槽中回温至稍有残冰，尔后吸出细胞液至先前准备好的培养液中，置于37℃及5% CO₂之培养箱中培养。

2.4.4. 细胞培养及继代(Cell Culture and Passage)

当细胞长到八分满的时进行继代培养，首先吸除旧有细胞培养液，用磷酸缓冲生理食盐水PBS洗去残留的血清及代谢物，加入1 mL胰蛋白酶typsin-EDTA后，置于37℃下作用3~5分钟，轻拍细胞盘侧促使贴附于盘底之细胞脱落，镜检确认细胞被切下后，以0.5 mL胎牛血清FBS中止胰蛋白酶的作用，以DMEM medium冲下细胞并收集于50 mL离心管中进行离心(条件设定为500× g，5分钟，4℃)，而后吸除上清液，再以DMEM medium回溶沉淀之细胞并进行计数，将细胞浓度调整为3 × 10⁵细胞/盘，最后种于细胞培养皿，并加入含有10% FBS之DMEM medium共10 mL，培养于37℃及5% CO₂之培养箱。

2.5. 细胞存活率试验(Cell Viability Assay)

将1 × 10⁴细胞/孔的MDCK种在96孔盘中，置于含有37℃与5% CO₂培养箱中培养24小时后，再分别加入不同浓度之桑黄萃取物作用48小时，利用MTS assay测其细胞存活率。培养液与MTS reagent添加的比例为5:1，将MTS reagent加入细胞液后，于培养箱中避光反应1小时，再使用ELISA reader在490 nm测量其吸光值进行计算。

2.6. 桑黄萃取物对于H1N1病毒感染之影响

先将桑黄水萃物和酒萃物分别以PBS以及DMSO溶解至适当浓度，将MDCK培养至96孔盘内，隔夜培养待细胞贴附后，以MTS assay测定桑黄萃取物对H1N1于不同感染时间点于MDCK存活率之效果。

2.6.1. 预防试验(Pre-Treatment)

在病毒吸附阶段前，于细胞中加入不同浓度桑黄萃取液于培养箱中作用1小时，吸除培养液后再加入m.o.i. = 0.05 (病毒感染剂量multiplicity of infection，MOI)之H1N1溶液与细胞于培养箱作用1小时，移除培养液并加入含2% FBS之新鲜DMEM培养液，于37℃、5% CO₂培养箱培养48小时，最后以MTS assay测其细胞存活率。

2.6.2. 共培养试验(Co-Treatment)

将不同浓度之桑黄萃取液与m.o.i. = 0.05之H1N1共培养1小时，之后将各浓度混和液分别加入细胞中于培养箱作用1小时，移除原培养液并加入含2% FBS之新鲜DMEM培养液，于37℃、5% CO₂培养箱培养48小时，最后以MTS assay测其细胞存活率。

2.6.3. 治疗试验(Post-Treatment)

于细胞中加入m.o.i. = 0.05之H1N1并放入培养箱中作用1小时，吸除培养液后分别加入不同浓度之桑黄萃取液再于培养箱中作用1小时，移除原培养液并加入含2% FBS之新鲜DMEM培养液，于37℃、5% CO₂培养箱培养48小时，最后以MTS assay测其细胞存活率。

2.7. 统计分析

实验数据结果以平均值标准偏差mean ± SD表示，主要以Student’s t-test进行统计分析，当p < 0.05表示在统计上具有显着差异，以*代表；当p < 0.01，则以**表示之。

3. 实验结果

3.1. 桑黄菌丝体水、酒萃物抗H1N1之效用

进行桑黄萃取物抗病毒试验前，先评估其对于病毒宿主细胞MDCK是否具有毒性影响。桑黄酒萃物以DMSO由最高浓度2 mg/mL连续对半稀释至0.0625 mg/mL，水萃物则以PBS从最高浓度2 mg/mL连续对半稀释至0.0625 mg/mL，进行MTS评估，结果显示桑黄酒萃物于0.25 mg/mL对于MDCK的细胞存活率大于80%；桑黄水萃物则于1 mg/mL对于MDCK细胞的细胞存活率大于80%，后续将以此浓度进行实验(图1)。

3.1.1. 预防

预防试验结果显示，桑黄酒萃物以及水萃物皆无法有效改善因H1N1病毒感染所造成的细胞毒杀现象(图2)。

3.1.2. 共培养

共培养处理的桑黄酒萃物之细胞存活率与H1N1组相比增加26.3% (p < 0.01)；水萃物则与H1N1组无显着差异(图3)。

3.1.3. 治疗

桑黄酒萃物组于攻毒后治疗试验中之细胞存活率与H1N1组相比提升了4.5% (p < 0.01)；水萃物之细胞存活率则与H1N1组无显着差异，无助于减缓病毒毒杀作用(图4)。

3.2. 桑黄酒萃物分层抗H1N1之效用

首先以MTS assay再次评估桑黄酒萃物分层在不同浓度下对MDCK之毒杀性，依据实验结果挑选存活率大于80%之浓度作为后续抗病毒试验之最高剂量，因此将PlH₂O、PlBtOH、PlDCM、PlHex的最高浓度分别设定为500、62.5、125、500 μg/mL (图5)。

3.2.1. 预防

预防处理时，与H1N1组相比，500 μg/mL的PlH₂O、PlHex组之细胞存活率分别提升5.65% (p < 0.05)、7.54% (p < 0.05)，且PlH₂O于250 μg/mL浓度下仍然具有显着差异；而125 μg/mL的PlDCM之细胞存活率提升29.09% (p < 0.05)，且PlDCM于62.5 μg/mL浓度下仍然具有显着差异；62.5 μg/mL的PlBtOH之细胞存活率提升17.42% (p < 0.001)，且于31.25 μg/mL的浓度下仍然具有显着差异(图6)。

3.2.2. 共培养

共培养处理条件下与H1N1组相比，125 μg/mL的PlDCM之细胞存活率提升40.67% (p < 0.001)，且于62.5 μg/mL仍具有显着差异；62.5 μg/mL的PlBtOH之细胞存活率则提升31.56% (p < 0.05)，低至于7.8125 μg/mL时也仍具有显着差异，且呈现剂量效应(图7)。

3.2.3. 治疗

治疗处理条件时，与H1N1组相比，500 μg/mL的PlH₂O之细胞存活率提升10.67% (p < 0.05)；125 μg/mL的PlDCM之细胞存活率提升23.97% (p < 0.01)，且于62.5 μg/mL仍具有显着差异；62.5 μg/mL的PlBtOH之细胞存活率则提升27.65% (p < 0.05) (图8)。

3.3. UPLC分析结果

比对标准品及数据库后，于滞留时间3.36 min及3.99 min，分别得到化合物Hispidin及Hypholomin B讯号。结果显示，四种桑黄酒萃分层中，PlH₂O、PlBtOH及PlDCM图谱皆出现明显的Hispidin讯号，但其中仅PlBtOH分层的图谱中同时也侦测到HB的讯号(表1)。

4. 讨论

本次采用之桑黄菌丝体，为自行于台湾采集之子实体中所分离而得，并完成菌种鉴定及多项动物实验确认其食用安全性，且可稳定大量培养 [5]。实验以H1N1病毒感染MDCK犬肾细胞作为感染模式，评估经样品处理后是否可以提升因病毒感染而下降的细胞存活率，为一种广泛被使用的细胞筛选模式。结果显示，桑黄酒萃物在共培养以及治疗试验中的效果都显着优于水萃物，但两样品于预防试验中皆未看见明显保护作用。水萃物在三项处理模式中皆未见到显着的活性，根据Chiu等人于2012年的研究指出，大分子物质如多醣可能会藉由包覆病毒颗粒或是覆盖于宿主细胞表面抑制病毒感染进而达到保护及预防感染的效果 [15]，对比本报告之研究结果显示，并未见到如上所述的现象，反观酒萃物则可显着提升细胞存活率，桑黄酒萃物中多为多酚类以及色素等小分子物质 [16]，除了被指出可调节巨噬细胞之免疫反应外 [17]，于体外试验中发现其亦可能直接作用于流感病毒表面膜蛋白，降低其感染活性 [14]，但也不排除为实验过程中酒萃物添加后，DMSO浓度被稀释，导致溶解度降低而析出沉淀于细胞表面，遮蔽病毒感染点进而达到抗病毒效用，所以仍需进行动物实验。

将酒萃物进行分层纯化，依其极性分作四层，分离萃取(partition)获得正己烷层(PlHex)、二氯甲烷层(PlDCM)、正丁醇层(PlBtOH)及水层(PlH₂O)共四个分层，分别进行UPLC分析及活性测试。结果显示无论是在预防、共培养或是治疗试验组，活性集中在二氯甲烷层(PlDCM)、正丁醇层(PlBtOH)两组，且其效果相当(共培养组存活率约在70%)，并皆显着优于正己烷层(PlHex)及水层(PlH₂O) (共培养组存活率约在40%)。另，三种处理模式中，以共培养最佳，治疗效果次之，预防结果为末。

为探究其实际作用之活性物质，经比对UPLC分析后，结果如表1，发现Hispidin含量分别为PlH₂O 1.16 ppm、PlBtOH 120.99 ppm及PlDCM 122.67 ppm，而HB则仅被发现于BtOH层(44.28 ppm)；由于共培养试验中PlDCM组内未发现HB，但仍具有活性，故推测Hispidin可能为活性成分之一。又由于PlBtOH最低有效浓度为7.2 ug/mL，而PlDCM则为125 ug/mL，两者作用浓度相差近18倍，故推测HB可能为另一个更有效的抗病毒活性成分。此与Hwang等人之研究成果相符 [14]，HB之活性优于Hispidin，至于最强的Phelligridin D则因缺乏标准品而未能评估。

本次实验中，发现到无论是桑黄萃取物或是其分层，皆属共培养试验模式最为有效，基于其试验设计，乃会先将样品与病毒进行接触混合一小时，再将其混合液与细胞接触进行攻毒，而此结果即造成病毒感染力下降，由此推测可能是样品即可直接对于病毒产生影响，使其对于细胞的杀伤力下降，而产生保护效果。另外，预防试验的保护效果皆不如治疗试验组，此现象与现今讨论度极高之抗病毒药物瑞德西韦(Remdesivir)雷同，亦是治疗效果胜于预防，其药理机制为当病毒感染进入细胞后，准备进行复制时，作用在病毒用以复制(replication)自身核酸所用之复制酶(RNA replicase)，进而使病毒无法顺利于感染细胞内增殖，达到阻断细胞被进一步感染的危机，此现象与文献 [14] 吻合，桑黄内多酚类物质可有效降低A型流感病毒膜蛋白上神经胺酸脢(neuraminidase, NA)之活性，抑制流感病毒于宿主细胞内完成复制后，裂解细胞进行下一步感染的流程 [18]。为验证此构想，虽以本篇研究报告中的数据仍不够解释，但可后续设计不同感染时间点其细胞内病毒表现量，进而推断是否作用于复制酶。预防试验之设计为将样品先与细胞接触一个小时后，以PBS洗去多余样品再加入病毒进行感染，却未见有效果，推测为先进入细胞之桑黄成份可能已被代谢转化，因此酒萃物及其分层内的活性物质无法确实于预防模式中发挥抗病毒效用。后续将进行动物试验以了解活体功效。

5. 结论

本实验证实，以液态发酵培养之桑黄菌丝体萃取物可有效缓解MDCK细胞因H1N1感染而导致的死亡现象，达到保护效果，且以共培养方式可产生最佳的抗病毒效果，并证明液态培养亦能产生Hispidin以及HB两种存在于桑黄子实体内的活性成分。

参考文献