1. 引言
植物一直是各种天然活性产物的重要来源，因此植物药用价值的研究对于植物的利用具有重要的意义。而草药可被用作化学药物的替代品，主要原因是与化学药物相比，草药伴随着更少的不良影响。异叶茴芹作为药食皆可的民间草药，在传统医学上早有记载，但关于其药用成分和作用功效的研究相对较少。
异叶茴芹Pimpinella diversifolia为伞形科茴芹属的多年生草本植物，别名八月白、苦爹菜、山当归，主要分布于长江以南各省 [1]。异叶茴芹作为一种传统民用草药，全草入药 [2]，具有活血祛瘀、排毒散肿等功效。1994年，董立莎等 [1] 对异叶茴芹进行生药鉴定。异叶茴芹含有香豆素类化合物，具有抗病毒、抗炎缓痛、抗肿瘤等多种药用功效 [3] [4]。它所含的芹菜素也是一种抗肿瘤成分 [5]。芹菜Apium graveolens 与香芹Petroselinum crispum同为伞形科植物，也含有一定量的香豆素和芹菜素，为常见蔬菜。
植物品质的好坏是衡量该植物是否具有较好利用价值的标准之一。但应用传统技术评价植物的内在品质，往往会对植物本身造成损伤且存在耗时长、费用大等问题。此外，同种植物、不同植株间的药用成分及抗氧化活性存在差异，在明确优质植物资源后，仍需进一步判断不同植株间的品质差异。目前关于药用植物及其药用部位的筛选研究已有较多报道，但利用无损检测技术快速评价植物内在品质的报道甚少。
本研究通过测定异叶茴芹、芹菜、香芹等三种伞形科植物茎、叶中的药用成分含量及抗氧化活性，进一步明确了异叶茴芹高效的药用及保健功效；同时，提供一种基于RGB强度值的颜色分形技术，建立数学模型，为无损预测植物的药用成分含量及抗氧化活性提供参考。
2. 仪器与材料
2.1. 仪器
九阳JYL-C16V搅拌机(九阳股份有限公司)、XM-5200UVF智能超声波清洗机(小美超声仪器(昆山)有限公司)、恒温(鼓风)干燥箱(宁波扬辉仪器有限公司)、752型紫外可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、Eppendorf AG离心机(德国Eppendorf公司)、Eppendorf3120系列移液器(德国Eppendorf公司)。
2.2. 材料
2.2.1. 材料采集
实验材料为异叶茴芹(Pimpinella diversifolia)、芹菜(Apium graveolens)与香芹(Petroselinum crispum)。异叶茴芹采集于浙江某苗圃，芹菜与香芹由杭州市江干区菜农提供。样品均经浙江理工大学生命科学与医药学院吕洪飞教授鉴定，且符合实验要求。
2.2.2. 材料处理
选取新鲜的异叶茴芹、芹菜和香芹，分别将其茎、叶分离，在流动的清水下洗涤其茎和叶，最后用蒸馏水冲洗干净。分别将相同部位的茎和叶剪碎后，以液固比30:1，加超纯水高速搅拌制得混合液。后将混合液置于50℃温度下超声提取60 min，制得粗提取液。并将粗提取液转移至离心管中，在4℃、12,000转/min的条件下进行高速离心。10 min后取上层澄清液作为提取液原液备用，所有的提取液均保存在4℃冰箱中。(图1)
Figure 1. Extract from the stems and leaves of Pimpinella diversifolia, A. graveolens and Petroselinum crispum. (a) Pimpinella diversifolia leaf extract; (b) Petroselinum crispum leaf extract; (c) A. graveolens leaf extract; (d) Pimpinella diversifolia stem extract; (e) Petroselinum crispum stem extract; (f) A. graveolens stem extract
图1. 异叶茴芹、芹菜和香芹的茎、叶的提取液。(a) 异叶茴芹叶提取液；(b) 香芹叶提取液；(c) 芹菜叶提取液；(d) 异叶茴芹茎提取液；(e) 香芹茎提取液；(f) 芹菜茎提取液
3. 方法
3.1. 药用成分含量测定
3.1.1. 总酚含量测定
1) 线性关系考察：使用没食子酸作为标准品，并测定不同浓度梯度的没食子酸溶液的吸光度。以没食子酸含量为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线，所得回归方程见表1。
2) 测定方法：异叶茴芹、芹菜和香芹的茎、叶中总酚(TP)含量测定参考Folin-Ciocalteu比色法 [6]。
Table 1. Linear relationship of seven chemical components
表1. 7种化学成分的线性关系
3.1.2. 总类黄酮含量测定
1) 线性关系考察：使用芦丁作为标准品，并测定不同浓度梯度的芦丁溶液的吸光度。以芦丁含量为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线，所得回归方程见表1。
2) 测定方法：异叶茴芹、芹菜和香芹的茎、叶中总类黄酮(TF)含量的测定参考AlCl3分光光度比色法 [7]。
3.1.3. 总可溶性糖含量测定
1) 线性关系考察：使用葡萄糖作为标准品，并测定不同浓度梯度的葡萄糖溶液的吸光度。以葡萄糖含量为横坐标(x)，以吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线，所得回归方程见表1。
2) 测定方法：参考马琴国等 [8] 的实验方法，略微修改后测定异叶茴芹、芹菜和香芹的茎、叶中总可溶性糖(SS)的含量。具体操作为：用移液枪精密吸取1.0 mL提取液于试管中，加入5.0 mL硫酸–蒽酮试剂(每1.0 L 80%硫酸溶液加入1.0 g蒽酮，80%硫酸溶液冷却至室温后再加入蒽酮)后马上置于沸水中反应10 min后自然冷却到室温，反应液使用分光光度计在620 nm波长处测量吸光度值，以水为空白对照。所有实验重复进行三次。
3.1.4. 芹菜素含量测定
1) 线性关系考察：使用芹菜素作为标准品，并测定不同浓度梯度的芹菜素溶液的吸光度。以芹菜素含量为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线，所得回归方程见表1。
2) 测定方法：参考黄圣等 [9] 的测定方法，略微修改后测定异叶茴芹、芹菜和香芹茎、叶中芹菜素含量。具体操作为：用移液枪精密吸取800 μL提取液于试管中，随后加入5.2 mL 80%乙醇，充分混合后使用分光光度计在335 nm波长处测量吸光度值。所有实验重复进行三次。
3.1.5. 总香豆素含量测定
1) 线性关系考察：使用蛇床子素作为标准品，并测定不同浓度梯度的蛇床子素溶液的吸光度。以蛇床子素含量为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线，所得回归方程见表1。
2) 测定方法：参考张恭孝等 [10] 的测定方法，略微修改后测定异叶茴芹、芹菜和香芹茎、叶中总香豆素含量。具体操作为：用移液枪精密吸取300 μL提取液于试管中，随后加入5.7 mL甲醇，充分混合后使用分光光度计在322 nm波长处测量吸光度值。所有实验重复进行三次。
3.2. 抗氧化活性检测
3.2.1. DPPH自由基清除活性测定 [11]
1) 线性关系考察：使用抗坏血酸作为标准品，并测定不同浓度梯度的抗坏血酸溶液的吸光度。以抗坏血酸含量为横坐标(x)，清除率为纵坐标(y)绘制标准曲线，所得回归方程见表1。
2) 测定方法：用移液枪精密吸取0.1 mL提取液加入到4.9 mL DPPH乙醇溶液(精密称量0.0075 g DPPH用乙醇定容至250 mL)中。将溶液充分混合并置于黑暗环境中反应30 min，使用分光光度计在517 nm波长处测量吸光度Ax，用0.1 mL提取液加入4.9 mL乙醇调零。DPPH乙醇溶液为空白吸光度A0。根据以下公式 [12] 计算DPPH自由基清除率：
清除率(%) = (1 − Ax/A0) × 100%。 (1)
所有实验重复进行三次。
3.2.2. ABTS自由基清除活性测定 [13]
1) 线性关系考察：参照“2.2.1”下的线性关系考察方法。
2) 测定方法：用移液枪精密吸取0.1 mL提取液加入到4.9 mL新鲜的ABTS溶液(量取7 mM的ABTS溶液10 mL，加入140 mM的过硫酸钾溶液178 µL，充分混合后避光保存12~16 h，使用前加水使其稀释到合适浓度，保证其在30℃、734 nm波长下的吸光度为0.7 ± 0.02)中。将溶液充分混合并置于黑暗环境中反应6 min，使用分光光度计在734 nm波长处测量吸光度Ay，用0.1 mL提取液加入4.9 mL水调零。ABTS溶液为空白吸光度A1。根据以下公式 [14] 计算ABTS自由基清除率：
清除率(%) = (1 − Ay/A1) × 100% (2)
所有实验重复进行三次。
3.3. RGB值提取
对异叶茴芹、香芹与芹菜的茎、叶提取液进行拍摄，以记录图像信息。图像的R值、G值、B值提取使用PS软件，每个处理重复三次。
4. 结果与分析
4.1. 药用成分含量
将“2.1”项下所得的各类吸光度值带入相应回归方程中，计算后得总酚、总类黄酮、总可溶性糖、芹菜素、总香豆素的含量，结果见表2。需特别说明，在本研究中，分光光度计的精度无法测量到芹菜和香芹中总香豆素的含量。结果表明，总酚、总类黄酮、芹菜素、总香豆素均在异叶茴芹叶内表现出最高的含量，分别高达7.28 mg GAE/g、38.98 mg GAE/g、0.89 mg AE/g、0.47 mg OE/g。而总可溶性糖则在异叶茴芹的茎中含量最高，为51.57 mg DE/g。
4.2. 抗氧化活性
4.2.1. DPPH自由基清除活性
将DPPH自由基清除率代入回归方程，DPPH自由基清除活性以每克提取物的抗坏血酸当量(ascorbic acid equivalent, AAE)毫克数，即以mg AAE/g表示。具体结果见表2。
据表中DPPH自由基清除活性的测定结果显示，异叶茴芹的叶中表现出最高的DPPH自由基清除活性，而其茎中的DPPH自由基清除活性与芹菜、香芹相比，差异并不显著。
Table 2. Total phenol, total flavonoids, total soluble sugar, apigenin, total coumarin and antioxidant activities in the stems and leaves of Pimpinella diversifolia, A. graveolens and Petroselinum crispum
表2. 异叶茴芹、芹菜和香芹的茎、叶中总酚、总类黄酮、总可溶性糖、芹菜素、总香豆素含量及抗氧化活性
“—”表示在未检出；同列标有不同字母者表示组间差异显著(P < 0.05)；同列标有相同字母者表示组间差异不显著(P > 0.05)。
4.2.2. ABTS自由基清除活性
将ABTS自由基清除率代入回归方程，ABTS自由基清除活性以每克提取物的抗坏血酸当量(ascorbic acid equivalent, AAE)毫克数，即以mg AAE/g表示。具体结果见表2。
据表中ABTS自由基清除活性的测定结果显示，异叶茴芹叶中ABTS自由基清除活性为3.30 ± 0.02 amg AAE/g，显著高于其他实验组。
4.3. 相关性分析
异叶茴芹、芹菜与香芹叶中RGB值与其药用成分及抗氧化活性的相关性分析
采用SPSS 20.0软件分别对异叶茴芹、芹菜与香芹的茎叶中RGB值与各组分进行相关性分析，具体结果见表3、表4。结果显示，R值、G值、B值均与其叶中的药用成分及抗氧化活性呈极显著负相关(P < 0.01)。植株颜色越深，则说明具有更高含量的药用成分和更强的抗氧化活性。此外，茎中的RGB强度值也与药用成分含量及抗氧化活性呈一定的负相关性。但叶中两者的相关关系更为显著。
Table 3. Correlation analysis of RGB intensity values in the leaves of Pimpinella diversifolia, A. graveolens and Petroselinum crispum with their medicinal constituents and antioxidant activities
表3. 异叶茴芹、芹菜与香芹的叶中RGB值与其药用成分及抗氧化活性的相关性分析
**P < 0.01。
Table 4. Correlation analysis of RGB intensity values in the stems of Pimpinella diversifolia, A. graveolens and Petroselinum crispum with their medicinal constituents and antioxidant activities
表4. 异叶茴芹、芹菜与香芹的茎中RGB值与其药用成分及抗氧化活性的相关性分析
**P < 0.01；*P < 0.05。
实验结果还发现，各植株叶中的DPPH自由基清除活性与总酚、总类黄酮、总可溶性糖、芹菜素、总香豆素呈r = 0.979、0.974、0.972、0.989、0.986 (p < 0.01)的极显著正相关，ABTS自由基清除活性与总酚、总类黄酮、总可溶性糖、芹菜素、总香豆素呈r = 0.996、0.996、0.986、0.998、1.000 (p < 0.01)的极显著正相关；植株茎中的ABTS自由基清除活性同样与各药用成分呈极显著正相关(P < 0.01)，但植株茎中的DPPH自由基清除活性与各药用成分间的相关性并不显著。
4.4. 数学模型建立
应用SPSS 20.0软件对三种伞形科植物茎、叶的RGB值与总酚、总类黄酮、总可溶性糖、芹菜素、总香豆素、DPPH和ABTS自由基清除能力进行多元线性关系拟合。所得线性拟合方程如表5、表6所示。在多元线性回归模型中，R值、G值、B值可较准确地预测叶中药用成分含量及抗氧化活性，具有极显著相关性，R2为0.997、0.979、0.980、0.996、0.996、0.978、0.995。在表6所示的数学模型中，总酚、总类黄酮、总可溶性糖、芹菜素、总香豆素、ABTS自由基清除活性与回归直线的拟合程度较高；但RGB值对预测茎中的DPPH自由基清除活性效果较差，R2为0.561。
Table 5. Mathematical model of medicinal components and antioxidant activity of leaves of three umbelliferae plants
表5. 三种伞形科植物叶中药用成分及抗氧化活性的数学模型
Table 6. Mathematical model of medicinal components and antioxidant activity of stems of three umbelliferae plants
表6. 三种伞形科植物茎中药用成分及抗氧化活性的数学模型
5. 结论
实验结果表明，异叶茴芹内的药用成分含量均高于香芹和芹菜，且三种实验植物的叶中药用成分含量均高于其茎中含量，因此异叶茴芹是三种伞形科植物中药用成分含量最高的物种，而叶是最佳的药用部位。此外，在三种植物的叶与茎中，芹菜素与总酚、总类黄酮、总可溶性糖、总香豆素、ABTS之间都存在极显著正相关(P < 0.01)；总香豆素与总酚、总类黄酮、总可溶性糖、ABTS之间都呈极显著正相关(P < 0.01)。R值、G值、B值可较准确地预测叶中药用成分含量及抗氧化活性，具有极显著相关性。
6. 讨论
6.1. 异叶茴芹的抗氧化活性
现今，随着物质水平的提高，养生保健理念流行。大众对进一步开发低毒性药用及保健资源的需求逐步提升。异叶茴芹，富含多种药用成分并表现出较强的抗氧化活性，兼具药用及保健功能。本研究结果显示，异叶茴芹内的各类药用成分含量均高于香芹和芹菜，可作为优质的药用植物。同时，异叶茴芹的叶中除总可溶性糖外的药用成分含量均显著高于茎中，说明其叶为最佳的药用部位。
据本研究“3.1”项下的实验数据显示，异叶茴芹内总酚类含量、总类黄酮含量均显著高于其他药用成分。酚类物质是普遍存在于植物中的次级代谢物。多酚结构中的酚羟基在快速捕捉活性氧等自由基的同时，可与环境中的氧结合，并被氧化为醌类结构 [15]。这使得酚类化合物表现出很强的抗氧化能力。同时，黄酮类化合物也作为一类抗氧化物质 [16]，广泛存在于异叶茴芹内。异叶茴芹可有效提供抗氧化活性物质，并有助于维持细胞内的氧化平衡，可作为医药及保健食品的优质资源。除此之外，针对各药用成分间的相关性分析，研究发现，异叶茴芹的抗氧化活性与其所含的各类药用成分密切相关，药用成分含量越高，则表现出越强的抗氧化活性。本研究为探索异叶茴芹的药用价值提供研究基础，也为合理开发利用优质植物资源提供理论依据。
6.2. 基于RGB分形的无损检测技术
植物品质的好坏是衡量该植物是否具有较好利用价值的标准之一。因而，如何精准、迅速、无损的预测植物品质并筛选最佳药用部位已成为一个日益重要的研究问题。RGB分形技术作为一种非破坏性品质评价方法，已得到广泛应用。Zheng等 [17] 基于分形分析和RGB强度值预测杨梅汁在贮藏过程中各成分含量变化，优选出高品质杨梅汁。Lou等 [18] 应用叶绿素荧光和RGB强度值对桑果发育过程中的抗氧化成分进行无损评价。此外，曾有研究报道，植物因具有不同的药用成分含量及抗氧化能力而显示出颜色差异。叶玲旭等 [19] 研究指出，不同颜色糙米内的酚含量不同；酚含量越高、抗氧化活性越强，糙米的颜色则越深。这些研究表明利用RGB分形技术无损伤筛选药用植物种类及最佳药用部位是可能的。
本研究探究了三种伞形科植物茎、叶中RGB值与药用成分含量、抗氧化活性等之间的相关关系。结果显示，通过分析其RGB强度的差异，能定性预测最佳药用植物种类，并判断其最佳药用部位。通过数学模型和RGB分形技术可无损预测异叶茴芹、芹菜、香芹茎、叶的药用成分含量及抗氧化活性，高效优选植物种类的同时，筛选其最佳药用部位。基于RGB分形的无损检测技术具有快速、简单、高效、精确等特点，可为工业化筛选优质植物资源提供参考，具有良好的应用前景。
NOTES
*通讯作者。